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甘薯加工方法多 福建医科大学小型离心机等实验室设备补充公告

第五章重组质粒的连接、及筛选

6、麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素时,携有载体DNA的子为淡红色菌落,而携有带插入片段的重组质粒子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选,且价格低廉。但需及时挑取白色菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色,影响挑选。

外源DNA片段: 自行制备的带性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体D第五章重组质粒的连接、及筛选NA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。

不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒子由于了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。

特殊情况下,外源DNA的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow段部分填平3凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段,一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同酶的识别序列组成的多克隆位点,因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的酶切位点的载体,从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时,在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳,同时以煮沸法抽提的pBS质粒做对照,有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。

3、带有平末端 是由产生平末端的酶或核酸外切酶消化产生,或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多,故在其连接反应中,T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA凝聚成聚集体的物质以提高效率。

pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近基因区段的突变体与带有完整的近基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别,它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的子在生色培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上,α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶,能分解麦康凯培养基中的乳糖,产生乳酸,使pH下降,因而产生红色菌落,而当外源片段插入后,失去α-互补能力,因而不产生β-半乳糖苷酶,无法分解培养基中的乳糖,菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。

6、含X-gal和IPTG的筛选培养基:在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

2、带有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化,亦得到同样的两个相同粘性末端,因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以,必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地质粒DNA的自身环化。带5端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。




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